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Uso de promotores de ADN para el mejoramiento vegetal. Una mirada a la expresión genética

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA

En todos los organismos pluricelulares cada una de sus células posee la misma información genética y sin embargo la expresión de genes difiere espacial y temporalmente (Fernández y col., 2002).

En cada tipo celular ciertos genes son expresados, mientras que otros están inhibidos (regulación irreversible) y otros se expresan según los requerimientos celulares (regulación reversible). Estas diferencias en cuanto a la expresión de genes en los diferentes tipos celulares viene dada como resultado de mecanismos de regulación a nivel transcripcional, postrancripcional, traduccional y postraduccional, siendo el punto de control principal, el proceso de transcripción, o más específicamente la fase de inicio de la transcripción (Gíl, 2010).

CONTROL TRANSCRIPCIONAL

El control transcripcional es una de las principales formas de controlar la expresión génica en las células, entendiéndose por “inicio de la transcripción” al ensamblaje total de la maquinaria de transcripción, que involucra la unión de factores de transcripción con la ARN polimerasa en el promotor (Iglesias, 2002).

El control transcripcional viene dado por la presencia de secuencias reguladoras de ADN actuando en cis (elementos cis) y factores de transcripción (elementos trans) que en conjunto disminuyen o aumentan la tasa neta de transcripción de un determinado gen (Cañón, 2004).

1.- ELEMENTOS EN CIS: PROMOTORES.

Los promotores son regiones de ADN situados en la región 5’ de un gen que poseen secuencias específicas, reconocidas por proteínas relacionadas a procesos de transcripción, que regulan la expresión de dicho gen (Cañón, 2004).

Debido a la arquitectura de los promotores, para realizar estudios de análisis funcional que comprendan la regulación específica de tejidos (o bien de tiempo o etapa de ciclo celular) es necesario conocer las secuencias cis y factores de transcripción, así como las interacciones entre estos elementos que en conjunto se requieren para la regulación concreta de un gen determinado (Iglesias, 2002).

Los promotores eucariotas constan de un determinado número de elementos cis, en donde en general, el que se observa con mayor frecuencia es la caja TATA, denominada así en base a su secuencia consenso (5'-TATAAA-3'), encontrándose centrada entre las posiciones -30 y -100 con respecto al inicio de la transcripción (+1) (Berg y col., 2008) (Fig. 1). También suelen hallarse otras secuencias consenso como las cajas CAAT y GC. La presencia, posición y orientación de ambas cajas varían según el promotor.


Figura 1. Promotor eucariota.
Tomado de: Levitus y col., (2009)

Los elementos cis pueden entonces separarse en, elementos que unen factores de transcripción generales (CAAT y GC) característico de promotores constitutivos; elementos de respuesta en donde la unión a factores de transcripción se da por la presencia de moléculas de señalización (por ejemplo de respuesta a hormonas), característico de promotores inducibles (Devlin, 2004); y elementos que son reconocidos por factores de transcripción específicos de tejido o etapa de desarrollo, propio de promotores específicos (Iglesias, 2002).

a) TIPOS DE PROMOTORES:

PROMOTORES CONSTITUTIVOS.

Los promotores constitutivos dirigen la expresión en todos los tejidos y en todo momento, pues su expresión no está condicionada por factores endógenos, lo que los hace muy útiles en estudios genéticos en plantas, en donde se requiere la producción de una proteína recombinante en todos sus tejidos (Cañón, 2004). El promotor más conocido y utilizado de este tipo es el 35S CaMV, que pertenece al Virus del Mosaico de Coliflor (Ruíz y col., 2005).

El Virus de Mosaico de Coliflor (CaMV) es un virus de ADN de doble cadena, que infecta un gran número de crucíferas y que para su replicación utiliza dos promotores el 35S y el 19S delante de sus genes de manera que engaña la maquinaria de la planta, estando siempre encendidos (Steinbrecher, 2002). Estudios realizados en plantas de tabaco demostraron la presencia de un potenciador localizado en -208 pb a -46 pb (fragmento de 126 pb) luego de duplicar la región -343 pb a -90 pb, en una fase anterior de la caja TATA (Rodríguez, 2004).

El promotor 35S ha sido ampliamente utilizado en ensayos de expresión transitoria de genes en frutos, hojas y raíces de diferentes plantas (Matsumoto y col., 2009), así como en combinación con otros promotores de expresión específica para estudios funcionales y de mejoramiento de los mismos (Haaren y Hounck, 1993). Sin embargo, a pesar de su gran utilidad y eficiencia no se recomienda para estudios de mejoramiento de plantas por los problemas de bioseguridad que se presentan al ser un promotor de origen viral.

Otros promotores constitutivos que se utilizan actualmente para ensayos funcionales de genes son los promotores homólogos de la actina (arroz, Arabidopsis thaliana) y el de la ubiquitina de maíz (Ruíz y col., 2005). La actina es un componente fundamental del citoesqueleto de las células, presente en todos los tejidos, determinando la forma celular, el movimiento de organelos, la división celular, entre otras funciones (Devlin, 2004).

McElroy y col., (1990), en estudios de transformación en arroz, reportaron que la región 5´del gen de la actina 1 (Act-1) del arroz, dirigía exitosamente la expresión de genes en protoplastos de arroz transformados. Este éxito fue debido a que dicha región está activa en casi todos los tejidos de las plantas (excepción en polen), por la presencia de elementos regulatorios positivos en la región de 834 pb upstream del sitio de inicio de la transcripción, esto es, además de TATA, un elemento poly (dA-dT) de 38 pb posicionado entre -245 pb y -152 pb, al cual se unen factores de transcripción para regular positivamente la actividad del promotor. Este gen posee además un intrón (intrón 1), el cual se ubica entre un exón no codificante (exón 1) y el primer exón codificante (exón 2), del cual se ha demostrado que es fundamental para la eficiencia de la actividad del promotor.

Hermann y col., (2001), aislaron el gen Act-1 en bananas, cuyo promotor (2.2 Kpb) mostró una fuerte expresión en hojas y raíces. Este promotor ha sido utilizado exitosamente para transformaciones en maíz, cebada, trigo, entre otros (Rodríguez, 2004).

La ubiquitina es una proteína cuya secuencia está muy conservada en los organismos eucariotas, implicada en procesos de reparación de ADN, respuestas a estrés por temperatura y a otros factores, control del ciclo celular, recambio proteico, entre otras funciones (Devlin, 2004).

Chistensen y col., (1992), identificaron y caracterizaron dos genes correspondientes a la ubiquitina, el gen de la ubiquitina 1 (Ubi-1) y el gen de la ubiquitina 2 (Ubi-2) en maíz, cuyas regiones reguladoras se ubicaban a -899 pb del sitio de inicio de la transcripción: la caja TATA a -30 pb, y dos secuencias superpuestas posicionadas entre -214 pb y -204 pb del sitio de inicio de la transcripción, similares a los elementos consenso de genes inducidos por calor, los cuales mejoran la expresión de la ubiquitina en respuesta al estrés por temperatura; además, un exón de 83 pb inmediato al sitio de inicio de la transcripción, y un intrón de 1 Kb, que se extiende desde la posición 84 pb a 1093 pb.

Toki y col., (1992), construyeron un gen quimérico utilizando el primer exón y el primer intrón del gen de la ubiquitina de maíz Ubi-1, junto al gen bar de Streptomyces hygroscopicus, logrando transformar y regenerar plantas de arroz resistentes a Bialafos.

PROMOTORES INDUCIBLES.

Los promotores inducibles dirigen la expresión de genes según la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos, por lo que han tenido una gran aplicación en ingeniería genética, ya que los genes que regulan pueden activarse o desactivarse en determinadas etapas del desarrollo de un organismo o tejido en particular (Rodríguez, 2004).

Dentro de los promotores inducibles los de mayor interés son los que responden a compuestos químicos, puesto que los que responden a factores físicos como la luz, calor, frío, estrés por daño, son muy difíciles de controlar fuera de un ajuste experimental (Cañón, 2004).

El promotor ALcR es un ejemplo de un promotor inducible por compuestos químicos. En presencia de etanol y de otros compuestos químicos relacionados, el factor de transcripción ALcR se une a las secuencia dianas del promotor del gen alcA, que codifica para la alcohol deshidrogenasa, primera enzima de la vía del metabolismo de etanol en hongos filamentosos, por lo que el alcohol actúa como inductor. Este promotor se ha probado en plantas de tabaco y Arabidopsis (Ruíz y col., 2005).

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE TEJIDOS U ÓRGANOS

Los promotores de expresión específica de órgano o tejido dirigen la expresión de genes como resultado de la interacción de varios niveles de regulación génica (Rodríguez, 2004).

Los elementos encontrados en los promotores de genes de plantas definen la especificidad de la expresión tejido específica ya sea esta en raíces, tejidos vegetativos, semillas o en otros órganos reproductivos. Para la determinación de promotores de expresión especifica es necesario estudiar los factores de transcripción que definen y regulan la expresión a nivel espacial y temporal en la plantas, así como las secuencias reguladoras reconocidas por estos factores directamente o indirectamente, a través de la interacción con otras proteínas (Cañón, 2004).

En los estudios de mejoramiento genético de plantas, los promotores homólogos o estrechamente relacionados a plantas son los preferidos, por ser los más confiables a la hora de expresar genes de interés en un tejido en particular (Rodríguez, 2004).

La importancia de los estudios de promotores de expresión fruto específica viene dada por el potencial biotecnológico para el mejoramiento de las características agronómicas como: retardo del proceso de maduración, aumento del valor nutricional (reservorios de nutrientes) y producción de proteínas de interés terapéutico (vacunas orales) (Granell, 2010), por lo que es necesario estudiar el desarrollo y maduración del fruto. El proceso de maduración viene acompañado de cambios en la textura, sabor, aroma y color del fruto; esto comprende eventos como el desmontaje de la estructura de la pared celular, cambios en los azúcares solubles, biosíntesis de pigmentos o en la producción de vitaminas, antioxidantes y otros compuestos (White, 2002).

Los ensayos de supresión de secuencias en la región 5´ promotora de un gen se han establecido como método para determinar los elementos reguladores negativos y positivos para la caracterización de promotores fruto específicos (Haaren y Hounck, 1993).

Los promotores que regulan la actividad de proteínas asociadas a los procesos de maduración como la taumatina, la almidón sintetasa, la quitinasa, la sacarosa fosfato sintetasa, la glucanasa, la ACC sintetasa, la ACC oxidasa, MaExp1, la ascorbato peroxidas, entre otras (Lim y col., 2004), son los más estudiados.

La mayoría de los estudios realizados en caracterización de promotores específicos de frutos se han hecho en tomate, descritos como promotores de respuesta a etileno (promotores inducibles) teniendo algunos mayor expresión que otros, entre ellos, E8, E4, E11, PG, SANT/MYB like-2, PHN, PFF, PLI, 2A11, PLE, PSN (Granell, 2010). El producto del gen E8 está involucrado en la biosíntesis de etileno, y en la maduración del fruto. El promotor de este gen (E8) se ha utilizado en ingeniería metabólica para incrementar el aroma del tomate; así como para expresar proteínas en frutos como vacuna oral para inmunizar ratones (Cañón, 2004).

El promotor del gen que expresa la poligalacturonidasa (PG) (asociado al ablandamiento de la fruta por desmontaje de la pared celular) se ha utilizado en ingeniería genética para expresar genes bacterianos que aumenten el contenido de carotenoides en la fruta (White, 2002).

b) SECUENCIAS REGULADORAS:

ELEMENTOS REGULADORES POSITIVOS.

Los elementos reguladores positivos son aquellas secuencias que activan o aumentan la transcripción del gen o genes que controlan (Iglesias, 2002); dentro de ellos encontramos las cajas TATA, CAAT, CG y los potenciadores.

La caja CAAT se considera indicativa de un promotor fuerte. Esta secuencia consenso (5'-GGNCAATCT-3') se ubica cerca de -80 pb del inicio de la transcripción, desempeñando un importante papel en la eficiencia de la expresión de un promotor. En plantas, esta secuencia es reemplazada por la caja AGGA (Rodríguez, 2004).

La caja GC es característica de genes constitutivos. Esta caja consiste en secuencias ricas en GC de unas 20-50 pb, cuya secuencia consenso es 5'-GGGCGGG-3' (Devlin, 2004).

Los potenciadores (enhancers) son elementos reguladores distales (40 a 50 Kb), que pueden encontrarse tanto en 5´ al promotor que regulan, como en intrones o en 3´a la región codificante del gen (Devlin, 2004). Los potenciadores aumentan significativamente la actividad de un promotor y son necesarios para establecer un estado activo de la transcripción. El funcionamiento de un potenciador a nivel molecular no está del todo claro pero existe evidencia de que éste podría actuar cambiando la estructura general del ADN, o interaccionando con la ARN polimerasa, por el hecho de que poseen módulos en común con los promotores (Jiménez y Merchant, 2003).ELEMENTOS REGULADORES NEGATIVOS.

Los elementos reguladores negativos actúan reprimiendo la transcripción, por lo que juegan un papel importante en la expresión espacial y temporal de genes. Son generalmente llamados silenciadores dividiéndose en elementos silenciadores y elementos reguladores negativos. Los silenciadores son una parte intrínseca de los promotores pudiendo estar situados en 5´ ó 3´, en intrones o en exones (Iglesias, 2002).

2.-ELEMENTOS EN TRANS: FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN.

En el control de la actividad genética los factores de transcripción son quienes en última instancia median el mecanismo de regulación transcripcional. En general, la transcripción en eucariotas está regulada por una serie de factores nucleares, como las ARN polimerasa I, II, III; factores de transcripción generales y factores de transcripción específicos de genes y tipo celular (Jiménez y Merchant, 2003).

Los factores de transcripción son proteínas que actúan modulando la expresión de genes que regulan (estimulándola o activándola) al unirse a motivos de ADN situados en posición cis o por interacciones con otras proteínas que participan en la formación de complejos proteicos transcripcionales (Fuertes, 1999).

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