Sistemas de transferencia de ADN utilizados en biotecnología vegetal

Los sistemas de transferencia de ADN consisten en la introducción de genes foráneos en las plantas con el propósito de adicionar un nuevo rasgo o modificación de alguno ya existente para su mejoramiento (Martínez y col., 2004). La ingeniería genética permite el acceso y manipulación directa de genes rompiendo las barreras impuestas por la divergencia genética (Sánchez, 2008).

En todas las técnicas desarrolladas para la introducción de genes foráneos se presenta una característica en común, que son las barreras por la que debe pasar el ADN foráneo para integrarse al genoma de la planta, esto es, atravesar la pared celular, luego la membrana citoplasmática y posteriormente llegar al núcleo (Martínez y col., 2004). Se han ideado diversos sistemas para la transferencia del ADN, unos más exitosos que otros, en los que se distinguen los de transferencia directa del ADN y los de transferencia indirecta del ADN basados en vectores biológicos.

1.- SISTEMAS DE TRANSFERENCIA DIRECTA (subtítulo).

Los sistemas de transferencia directa del ADN son considerados los sistemas universales, porque al no depender de organismos vectores pueden aplicarse a cualquier especie vegetal. Estos sistemas se basan en la introducción de ADN foráneo por métodos físicos o químicos al interior de una célula, tejido, órgano u organismo (Mentaberry, 2007). Entre las técnicas de transferencia directa del ADN, las más conocidas y empleadas son la biobalística y la electroporación.

BIOBALÍSTICA

La biobalística fue ideada a principios de los ochenta por el biólogo molecular Stanford, quien se encontraba en la búsqueda definitiva para transformar plantas, por lo que 1984 estableció junto E. Wolf, director de un centro de fabricación de partículas, el método de bombardear células vegetales con ADN (Sánchez, 2008). Debido a la flexibilidad y fragilidad de la molécula de ADN decidieron engancharla a micropartículas metálicas, aprovechando el hecho de que en presencia de cloruro de calcio y espermidina el ADN queda adherido por interacciones del tipo no covalente a las micropartículas (Martínez y col., 2004).

Los proyectiles utilizados para el bombardeo usualmente son de tungsteno u oro, de aproximadamente 0,4 a 2,0 µm de diámetro (forma esférica) y la velocidad de las partículas puede ser generada por la explosión de una carga de pólvora o por descarga de gases a elevadas presiones como helio o dióxido de carbono. El desprendimiento del ADN de las micropartículas, una vez dentro de la célula vegetal se da por modificaciones del entorno iónico (Sánchez, 2008).

Actualmente, la biobalística constituye el único método que permite transformar organelos celulares de modo reproducible. El modelo más utilizado como acelerador de micropartículas, es el cañón de alta presión de helio PDS-1000/ He® (Fig. 1)

Figura 1. Acelerador de micropartículas PDS-1000/He®.
Tomado de: Levitus y col., (2009).

La técnica ha sido aplicada en muchas investigaciones, en donde, el tamaño de la micropartícula y la presión empleada son determinante del éxito de la técnica; en función a esto se han transformado embriones somáticos de mango con gran éxito (Chavarri y col., 2004).

Sin embargo, la biobalística presenta el problema de que se generan dos tipos de célula, unas transformadas y otras no transformadas dentro de un mismo organismo, por lo que la competición entre células para seguir un desarrollo disminuye la eficacia del método (Sánchez, 2008).

ELECTROPORACIÓN

La electroporación es un método directo de transferencia de genes que se basa en el uso de pulsos eléctricos cortos de alta intensidad, los cuales aumentan la permeabilidad (electropermeabilidad) de la membrana celular facilitando la entrada de moléculas de ADN en las células. Estos poros son transitorios y pueden existir por más de 10 minutos antes de volver a cerrarse. El diámetro de los poros puede exceder los 30 nm (Sánchez, 2008).

El pulso de electroporación es generado por descarga de un condensador a través de los electrodos en una cámara diseñada para el electroporador (Fig. 2). El grado de incorporación está determinado por la intensidad de los pulsos eléctricos, así como de la conductividad del medio. La mayoría de los estudios hechos en plantas en donde se usa esta técnica es para la introducción de genes de resistencia contra diferentes compuestos químicos (Saunders y col., 1989).

Figura 2. Equipo de electroporación.
Tomado de: Levitus y col., (2009)

Esta técnica de transferencia directa de ADN se ha establecido como protocolo de transformación en plantas de plátano para la introducción de genes de resistencia al herbicida glufosinato de amonio (BASTA) (García y Villarroel, 2002).

2.-SISTEMAS DE TRANSFERENCIA INDIRECTA (subtítulo).

En 1970 se planteó la hipótesis de que la enfermedad de las plantas denominada agalla del cuello podría ser producida por la transferencia de material genético entre una bacteria, Agrobacterium tumefaciens, y las células vegetales. En 1973, se anunció el descubrimiento del plásmido Ti (Tumour inducing) en cepas de Agrobacterium tumefaciens, el cual era portador del carácter patógeno. Estudios posteriores determinaron la presencia de un fragmento de éste plásmido en las células con tumores por lo que se le denominó ADN-T (ADN transferido). Más tarde se demostró que el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens posee varias funciones: la función de virulencia (Vir), encargada de la transferencia del ADN-T; la oncógena (Onc), responsable del tumor (síntesis de auxinas y citoquininas), la función para la síntesis de alimentos para la propia bacteria, opinas (Ops), y la función catabólica (Opc) (Fig. 3) (Sánchez, 2008). Se distinguen en estas funciones: las que se expresan en la bacteria (situadas fuera del segmento de ADN-T) y las que se expresan en la célula vegetal después de la transferencia (controladas por el segmento ADN-T).

Figura 3. Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.
Tomado de: Sánchez (2008).

La región trasferida e integrada al genoma de la planta es la comprendida dentro del segmento ADN-T, limitado por dos señales, “promotor” al inicio y el “terminador” al final, por lo que en teoría es posible transferir cualquier gen foráneo colocado entre estas dos secuencias (Martínez y col., 2004).

Las ventajas de este sistema de transferencia de ADN frente a otras técnicas viene dada por el hecho de que los segmentos de genes foráneos introducidos se encuentran en una sola copia en un porcentaje importante del evento de transformación; existen vectores con los bordes de ADN-T unidos a genes reporteros y de selección, lo que permite ajuste apropiado de las condiciones de transformación y selección de células transformadas; y la posibilidad de transferir grandes segmentos de ADN (Sánchez, 2008).

Referencias bibliográficas:

Chavarri, M; Vegas, A; Zambrano, A; Demey, J. (2004). Trasnformación de embriones somáticos de mango por biobalística. Interciencia. 9 (005): pp 261-266. Disponible en http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=33909206.

García, E; Villarroel, C. (2002). Transformación de plantas de plátano cv. Hartón (AAB) mediante electroporación de meristemos. Sesión cartel de fitomejoramiento y biotecnología. Acorbat. Disponible en: http://musalit.inibap.org/pdf/IN030009_es.pdf.

Levitus, G; Rivero, M; Segretin, M; Morgenfeld, M, Zelada, A. (2009). Agrobiotecnología. Guía de trabajos prácticos (Curso 2009). Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Buenos Aires, Argentina. Disponible en: www.fbmc.fcen.uba.ar

Martínez, M; Cabrera, J; Herrera, L. (2004). Las plantas transgénicas: una visión integral. Redalyc. Disponible en: redalyc.uaemex.mx/pdf/730/73000202.pdf.

Mentaberry, A. (2007) Biobalística y otros sistemas de transferencia directa de ADN. Curso de Biotecnología. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Buenos Aires, Argentina. Disponible en: www.fbmc.fcen.uba.ar.

Sánchez, C. (2008). “PLANTAS TRANSGÉNICAS”. Biotecnología y Alimentos. Disponible en: www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos.

Saunders, J;.Matthews, B; Miller, P. (1989). Plant Gene Transfer Using Electrofusion and Electroporation. Electroporation and Electrofusion In Cell Biology. Capítulo 22. Disponible en:pages.towson.edu.PlantGeneTransferUsingElectrofusionandElectro.